PERBEDAAN KARAKTERISTIK VEKTOR KLONING PADA E. coli dan S. cerevisiae

A.    Ciri-Ciri Vektor Secara Umum

1.      Mempunyai “ori”-origin of DNA replication.

2.      Mrupakan selectable maker yang dominan, memungkinkan sel yang membawa plasmid rekombinan dapat dibedakan dengan mudah.

3.      Punya restriction cleavage sites yang unik, sisi tersebut hanya satu di dalam vektor untuk menyisipkan fragmen DNA.

B.     Karakteristik Vektor E. coli

E. coli merupakan organisme prokariot. Bakteri ini memiliki plasmid. Plasmid adalah DNA ekstrakromosom yang kecil, sirkuler, yang mereplikasi secara independen. Kebanyakan (secara eksperimental) berasal dari spesimen tunggal. Plasmid E. coli merupakan jenis plasmid high copy number.

E. coli memiliki keterbatasan sebagai hospes. Keterbatasan itu antara lain:

1.      E. coli tidak dapat melakukan modifikasi produk protein.

2.      E. coli tidak mempunyai kemampuan folding protein rekombinan dengan baik.

3.      E. coli mungkin mendegradasi protein (karena merupakan protein asing bagi E. coli)

Solusi untuk mengatasi hal itu antaralain:

1.      Solusi untuk mengatasi masalah E. coli tidak dapat melakukan modifikasi produk protein adalah tidak ada solusinya. E. coli hanya digunakan untuk sintesis protein hewan yang tidak perlu protein processing seperti insulin.

2.      Solusi untuk mengatasi masalah E. coli tidak mempunyai kemampuan folding protein rekombinan dengan baik adalah dengan memilih strain E. coli yang banyak mensintesis protein choperon. Protein ini akan bertanggung jawab terhadap protein folding di dalam sel bakteri.

3.      Masalah ketiga yaitu E. coli mungkin mendegradasi protein, solusinya adalah pada ekspresi gen mamalia dalam bakteri digunakan strain E. coli mutan yang tidak punya enzim protease. Sehingga protein hasil teknologi rekombinan ini tidak terlisiskan.

C.    Karakteristik Vektor  Saccaromyces cerevisiae

Saccaromyces cerevisiae telah digunakan sebagai inang untuk ekspresi gen
eukariot dengan alasan-alasan sebagai berikut:

1.      Ber-sel tunggal dan sudah dipelajari secara genetik maupun fisiologi.

2.      Beberapa promotor gen yang kuat telah diisolasi dari ragi ini dan
dikarakterisasi. S. cerevisiae secara alami mengandung plasmid yang
disebut plasmid 2µm dan dapat digunakan sebagai vektor ekspresi.

3.      S. cerevisiae mempunyai mekanisme modifikasi pasca translasi.

4.      Ragi ini biasanya mensekresikan beberapa protein. Jadi apabila
protein heterolog direkayasa untuk dibebaskan secara ekstraselular,
maka produk dapat segera di purifikasi.

5.      Karena sudah bertahun-tahun digunakan pada industri makanan, S.
cerevisiae sudah didaftarkan oleh U.S Food and Drug Administration
sebagai organisme “generally recognize as safe” (GRAS).

Oleh karena itu penggunakan organisme ini untuk produksi agen
terapetik manusia (drug or pharmaceuticals) tidak membutuhkan penelitian
secara ekstensif seperti yang diwajibkan untuk inang yang belum terjamin
keamanannya. Dewasa ini terdapat sejumlah protein yang telah diproduksi
di S. cerevisiae, dan digunakan secara komersial sebagai vaksin, agen
terapeutik, dan untuk diagnose. Sebagai contoh lebih dari 50%
suplai insulin dunia diproduksi oleh S. cerevisiae.

Terdapat tiga kelas utama vektor ekspresi untuk S. cerevisiae: episom atau plasmid, yaitu vektor Yeast Episomal plasmid [YEps], vektor integrasi
(Yeast Integrating plasmid [Yips] dan Yeast Artificial kromosom [YACs]. Vektor-vektor ini telah digunakan secara ekstensif untuk memproduksi
protein heterolog intra atau ekstraselular.

Vektor YEp direkayasa dari plasmid 2µm dengan jumlah copy tinggi. Seleksi berdasarkan pada mutan strain inang yang membutuhkan asam amino
tertentu (histidin, triptofan atau leusin) atau nukleotida urasil untuk
pertumbuhan. Strain ini disebut bersifat auxotrof karena medium
pertumbuhan harus diberi suplemen dengan nutrient spesifik. Dalam
prakteknya vektor ini dilengkapi dengan versi gen wild type yang menjadi
komplemen dari gen yang dimutasi di sel inang. Sebagai contoh, bila
plasmid YEp dengan gen LEU2 wild type, ditransformasi ke sel inang mutan
leu2 dan kemudian ditumbuhkan pada media yang tidak ada penambahan
leusin, maka hanya sel yang membawa plasmid yang akan tumbuh.

Sejumlah promotor dari gen S. cerevisiae sudah diambil untuk
efisiensi rekayasa transkripsi gen heterolog dalam vektor ragi. Pada
umumnya vektor-vektor ini dapat diregulasi dengan ketat. Promotor yang
dapat diinduksi lebih disukai untuk produksi sejumlah besar protein
rekombinan selama pertumbuhan skala besar. Dalam kasus ini promotor
yang diregulasi oleh galaktosa, merespon sangat cepat penambahan
galaktosa, yang menaikkan efisiensi transkripsi sampai 1000x. Promotor
yang dapat direpresi, konstitutif dan promotor hibrida yang
menggabungkan sifat promotor yang berbeda juga tersedia. Tingkat ekspresi
maksimal tergantung pada efisiensi terminasi transkripsi. Pada umumnya
untuk vektor YEp urutan terminator dan promotor diambil dari gen yang
sama.

Urutan pengode gen heterolog pada umumnya dilengkapi segmen
asam amino (urutan pengenal, peptida pengenal, dan urutan pemula) yang memfasilitasi perjalanan protein rekombinan melewati membran sel dan
pelepasan protein ke luar sel. Alasan utama modifikasi ini adalah lebih
mudahnya memurnikan protein yang disekresikan dibandingkan protein
yang terdapat dalam lisat sel. Urutan pengenal yang umum untuk S.
cerevisiae diambil dari gen α mating factor. Urutan pengenal sintetik juga
sudah dirancang untuk menaikkan jumlah sekresi protein. Urutan lain yang
menstabilkan protein rekombinan, mencegah degradasi proteolisis, dan
menyediakan urutan asam amino spesifik (affinity tag) yang digunakan
untuk purifikasi secara selektif, dapat digabungkan ke urutan pengode gen
heterolog. Asam amino tambahan ini dilengkapi oleh sisi pemotongan
protease sehingga bisa dipotong dari protein rekombinan setelah
dimurnikan.

Sistem ekspresi ragi yang menggunakan plasmid kadang-kadang
tidak stabil pada kondisi pertumbuhan skala besar (≥ 10 L) walaupun diberi
tekanan. Untuk mengatasi masalah ini, peneliti telah menguji apakah
integrasi gen heterolog dapat menyediakan sistem produksi yang dapat
diandalkan. Pendekatan yang berbeda telah dilakukan untuk ko-integrasi
klon dan gen penanda seleksi ke kromosom S. cerevisiae . Lebih jelasnya gen
penanda seleksi fungsional dan gen heterolog ditambahkan dengan urutan
pengontrol transkripsi dan translasi yang spesifik untuk ragi, di insersikan
antara dua segmen DNA yang berasal dari ujung gen non esensial pada ragi.
Pada contoh ini, plasmid tidak selalu membawa ORI yang berfungsi pada sel
ragi. Plasmid dipotong pada ujung dari dua segmen ragi. Setelah
transformasi, melalui peristiwa rekombinasi ganda terjadi insersi DNA
dengan dua gen ke sisi kromosom spesifik (gambar 2). DNA plasmid
dilinearisasi karena DNA dalam bentuk ini lebih disukai dibanding DNA
sirkular untuk berekombinasi dengan DNA kromosom. DNA yang tidak
terintegrasi hilang selama pembelahan sel. Kekurangan utama strategi ini
adalah rendahnya hasil protein rekombinan dari satu copy gen.

Ragi Saccharomyces cerevisiae adalah salah satu organisme yang paling penting dalam biotechnology.seperti  perannya dalam pembuatan bir dan breadmaking, ragi telah digunakan sebagai organisme inang untuk produksi obat-obatan penting dari kloning gen (hal. 292). Pengembangan vektor kloning untuk khamir telah sangat dirangsang oleh penemuan sebuah plasmid yang hadir di kebanyakan strain S. cerevisiae. Plasmid 2mm, seperti yang disebut, adalah salah satu dari hanya sangat terbatas jumlah plasmid yang ditemukan pada sel eukariotik .